乳酸菌細胞吸附霉菌毒素以減除霉菌毒素的毒害作用閱讀次數 [5387] 發布時間 :2017-09-20

乳酸菌細胞吸附霉菌毒素以減除毒素的毒害作用

  胡文鋒，李希，雷柳琳，龐旭，徐健，周舟

（華南農業大學食品學院，廣州五山，510642）

 摘譯、改寫自：Amal S. Hathout, Soher E. Aly

 Biological detoxification of mycotoxins: a review

  Ann Microbiol (2014), 64:905-919.

       霉菌產生的霉菌毒素污染了25％人類消費的谷物和糧食，其中，黃曲霉毒素的毒性最大(Wild and Turner, 2002; CAT, 2003) 。黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）和紅綬曲霉（Aspergillus nomius）污染的玉米、高粱、大米、花生、堅果、無花果、生姜、肉豆蔻和牛奶，可產生對肝臟致癌的黃曲霉毒素(Ellis et al., 1991; FDA, 2012) 。黃曲霉毒素是由一些曲霉屬真菌合成的低分子量的次級代謝產物。黃曲霉毒素包括四種類型，分別是黃曲霉毒素B1（最致癌）、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2。它們在兔子體內的最大半致死劑量（LD50）值為0.3mg / kg BW，老鼠為18mg / kg BW(Moss, 1998；IARC, 2002; FDA, 2012)。2012年，黃曲霉毒素被國際癌癥研究機構歸類為1類致癌物質(i.e., carcinogenic to humans; IARC, 2014) 。

       許多國家經常報道食品和飼料中發現了黃曲霉毒素污染。例如，有報告顯示，農產品被高水平的黃曲霉毒素B1污染，包括干果、谷物、水果、蔬菜、香草和香料，其最高含量超過了最大允許限度(Chen et al., 2013; Guchi, 2015; Waliyar et al., 2015) 。此外，牛奶和奶制品（包括奶酪，酸奶和奶油）中出現黃曲霉毒素M1的污染，甚至在巴氏殺菌后的牛奶中仍存在(Yitbarek and Tamir, 2013)  。此外，在Greater Addis Ababa奶牛棚里，發現在牛奶和乳牛飼料中有高水平的黃曲霉毒素，污染水平分別為0.028-4.98μg/ L和70-419μg/ L (Gizachew et al., 2016) 。

        減少霉菌毒素對人和動物毒素作用的常用方法是利用各種霉菌毒素結合劑或吸附劑來降低其生物利用度，從而減少霉菌毒素的攝取。近年來人們開發了物理、化學和生物的方法去除食品或飼料中的霉菌毒素。本文只介紹乳酸菌的吸附去毒作用及機制。

 

雙歧桿菌屬去除霉菌毒素

       雙歧桿菌是乳酸菌之一，革蘭氏陽性，無運動性，經常分支的厭氧細菌屬。它們是普遍存在于哺乳動物和其他動物的胃腸道和口腔內共生菌，其中一些雙歧桿菌是益生菌。 Peltonen等人（2001）研究了五種雙歧桿菌菌株在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的對黃曲霉毒素B1（AFB1）的結合能力，發現雙歧桿菌菌株結合AFB1的18.0-48.7％。Fuchs等（2008）通過雙歧桿菌研究了兩種豐富的常見的霉菌毒素，赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）和棒曲霉毒素（patulin，PAT）的解毒作用，發現兩株長雙歧桿菌（LA 02，VM 14）菌株的解毒作用非常高效，OTA降低了約50％；而對于PAT，用動物雙歧（VM12）菌株觀察到最強的作用（約降低80％）。Hateb等人（2012a）報道，雙歧桿菌671在培養24小時后，其最大吸附值達活細胞52.9％，滅活細胞54.1％。

       有人研究了兩株乳制品源的雙歧桿菌在磷酸緩沖液（PBS）和復原乳中去除AFM1的能力，結果表明活細胞（10^8 CFU/ml）和熱滅活雙歧桿菌對黃曲霉毒素M1去除率分別達到14.04％至28.07％，在PBS和復原乳中分別為12.85％至27.31％（Kabak和Var 2008）。以前的研究還發現，長雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的AFM1結合能力分別達到26.7％和32.5％（Kabak和Var 2004）。

       另外，Lankaputhra和Shah（1998）研究了9株雙歧桿菌的活細胞和滅活細胞對八種化學誘變劑和前誘變劑（promutagens）（N-甲基，N'-硝基，N-亞硝基胍，2-硝基呋喃，四氫呋喃，四氫呋喃， ，2-硝基喹啉-N-氧化物; AFB1; 2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并喹啉; 2-氨基-1-甲基-6-苯基 - 咪唑并（4,5-b）吡啶 ，和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并（3,3-6）吲哚））的抗誘變活性，包括。 作者報道，其中6株雙歧桿菌對抑制AFB1毒性其效果不明顯。

 

乳酸菌（乳桿菌）去除霉菌毒素

Aflatoxins 黃曲霉毒素

       乳酸菌（LAB）的某些乳制品源菌株可有效地從溶液中去除AFB1，這是最常見的黃曲霉毒素（El-Nezami等，1996，1998a）。El-Nezami等人 （1998b）評估了5種乳桿菌物質體外結合黃曲霉毒素的能力，發現益生菌菌株如鼠李糖乳桿菌GG和鼠李糖乳桿菌LC-705對于除去AFB1是非常有效的，其中在20μg mL-1溶液中超過80％的毒素被捕獲。同時假設AFB2、AFG1和AFG2對這種結合過程不太敏感（El-Nezami等人2002b）。Peltonen等人 （2000）補充研究發現，益生菌從緩沖溶液中除去AFB1的范圍為5.8-31.3％。 Peltonen等人 （2001）研究了12種乳桿菌和3種乳球菌菌株在PBS中對AFB1的結合能力。在他們的研究中，乳桿菌結合17.3-59.7％的AFB1，而乳球菌屬菌株結合了5.6-41.1％的AFB1。 Khanafari等人 （2007）研究了植物乳桿菌（PTCC 1058）結合AFB1的功效，吸附1小時后從溶液中除去了45％的AFB1，高壓滅菌的細菌去除AFB1的能力為1小時內約31％。 作者補充說，三次洗滌后，益生菌保留了92％的AFB1。 AFB1通過LAB的體外結合為快速（不超過1分鐘）和可逆過程（Bueno等，2006），其為菌種和劑量依賴性（Kankaanp??等，2000）。

         Hernandez-Mendoza等 （2009）根據結合AFB1的能力，篩選出8株干酪乳桿菌，其吸附率介于14?49％。 以前的關于干酪乳桿菌對AFB1結合水平的研究發現其結合率介于0.6至46％之間（Bolognani等，1997; El-Nezami等，1998a; Peltonen等，2000,2001; Haskard等，2001; Lahtinen等 2004; Hwang et al.2005; Zinedine et al.2005）。 Hernandez-Mendoza等 （2010）提出，即使在長時間的毒素暴露后，干酪乳桿菌Shirota的存在也可以降低腸道水平的黃曲霉毒素吸收，從而降低其毒性作用。 他們補充說，干酪乳桿菌Shirota具有將AFB1結合到細菌細胞外套膜中的能力，并且圖像還顯示，黃曲霉毒素結合導致細菌細胞表面結構變化，從而改變了細菌細胞表面。

       Halttunen等人 （2008）研究了LAB組合菌株去除霉菌毒素的能力，并揭示了LAB組合菌株的毒素去除能力不是其個體能力的總和。 因此，當目標是去除單一毒素時應使用純的單一菌株，當要一起去除多種毒素時，使用組合菌株可能更有效。

       Lankaputhra和Shah（1998）研究了6株嗜酸乳桿菌的活細胞和滅活細胞對8種化學誘變劑和前誘變劑（promutagens）（N-甲基，N'-硝基，N-亞硝基胍; 2-硝基呋喃; 4-硝基-O苯二胺; 4-硝基喹啉-N-氧化物; AFB1; 2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并喹啉; 2-氨基-1-甲基-6-苯基 - 咪唑并[4,5-b]吡啶和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[3,3-6]吲哚）的抗誘變活性，包括AFB1。作者報道，除嗜酸乳桿菌2415株外，所有嗜酸乳桿菌菌株均在高濃度時抑制AFB1的基因毒性（> 50％）。發酵乳制品或益生菌的抗誘變活性的機理尚未明確（Nadathur等，1994）。誘變劑與微生物細胞的結合可能成為抗誘變性的作用機制（Orrhage等，1994）。Cenci等（2008）研究了鼠李糖乳桿菌GG對抗基因毒素的效果，包括AFB1（4-硝基喹啉-1-氧化物，N-甲基-N-硝基 - 亞硝基胍，2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉和AFB1 ），結果顯示其具有很高的抗AFB1基因毒性的能力（80.8％）。

         根據污染水平和孵化期的不同，活的乳桿菌細胞濃度為108 CFU mL-1在PBS中的對AFM1結合率為10.22%?26.55％（Kabak和Var 2008）。 他們補充道，熱滅活細菌在PBS中去除AFM1的百分比為14.04%至28.97％。似乎滅活細胞的吸附能力更強。類似地，Kabak和Var（2004）發現，乳桿菌在PBS和復原乳中的AFM1的結合能力為25.7％至30.5％之間。 這些結果低于Pierides等報道的結果（2000），他發現，培養15~16h，活乳酸桿菌菌株結合AFM1能力為18.1%?50.7％。

Ocharatoxin A 赭曲霉毒素A（OTA）

       由于乳桿菌和鏈球菌的作用，在牛奶中觀察到OTA的降解（Skrinjar等，1996）。 Turbic等 （2002）的研究結果顯示，OTA（36-76％）被高濃度和適量濃度的鼠李糖乳桿菌菌株去除。同時，Heidler和Schatzmayr（2003）清楚地表明，從瘤胃液中分離的牛犢乳桿菌（Lactobacillus vitulinus）能夠將OTA分解成無毒代謝物赭曲霉毒素α（OTα）和氨基苯丙氨酸。類似的研究表明，乳桿菌能夠消除添加到培養基中的0.05 mg L?1 OTA，特別是保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌，分別消除了94％, 72％和46％的OTA（B?hm et al。2000）。

       Del Prete et al.（2007）研究了OTA與葡萄酒LAB（乳桿菌屬、片球菌屬和歐洲綠球菌）的體外相互作用。 結果顯示，在液體合成培養基中生長的幾種葡萄酒LAB菌株引起的OTA濃度降低。 OTA濃度的降低范圍為8.23％?28.09％。 還有人注意到，商業亞麻型菌株比其他分析的葡萄酒LAB更有效，OTA降低范圍為17.35至28.09％。

       在腸道和植物來源的LAB菌株消除OTA的研究中，Piotrowska和Zakowska（2005）根據對OTA的敏感度及其從液體培養基中去除這種毒素的能力篩選出乳桿菌屬和乳球菌屬的29株LAB。 他們補充道，使用嗜酸乳桿菌CH-5、鼠李糖乳桿菌GG、植物乳桿菌BS、短乳桿菌和乳酸乳桿菌獲得最大吸附量，除去超過50％的初始濃度的OTA。Piotrowska和Zakowska（2000）得出結論，通過與細菌生物量的結合發生毒素的消除。

       Fuchs等人 （2008）研究了LAB對OTA的脫毒作用。他們發現，嗜酸乳桿菌對OTA含量的降低作用最強（97％）。因而值得注意的是，瘤胃代表微生物群落是通過裂解OTA肽鍵而解毒，從而有苯丙氨酸釋放出來（Hult等，1976;?zpinar等，1999）。

Patulin展青霉毒素（棒曲霉毒素，PAT）

       Fuchs等人 （2008）研究了LAB對展青霉毒素（PAT）的影響，并注意到植物乳桿菌降低PAT含量的作用最強（39％）。 Hateb等人 （2012a）報道，水溶液中PAT最大吸附量為培養24小時后的乳酸桿菌6149菌株，其活細胞達到51.1％，滅活細胞達到52.0％。 PAT的最高去除率條件為pH4.0和37℃，并且隨著毒素濃度的降低而升高。有人使用10種不同的滅活LAB從蘋果汁中去除PAT污染，結果表明,鼠李糖乳桿菌滅活細胞可降低PAT達80.4％（Hateb等，2012b）。

Fusarium toxins鐮刀菌毒素

       已知某些LAB菌株能夠解毒鐮刀菌毒素（DON、NIV、T-2毒素、HT-2毒素）（El-Nezami等，2002a; Niderkorn等，2006）和玉米赤霉烯酮（ZEN） （El-Nezami等，2002c，2004）。 Niderkorn等人（2006）發現，盡管伏馬菌素FB1和FB2的化學結構相似，但FB2比FB1的去除率更高。 他們認為，是通過細菌細胞結合鐮刀菌霉菌毒素而不是生物降解的方式去除毒素。因此，吸附脫毒不存在關于毒素的酶解產物的毒性問題。霉菌毒素-LAB相互作用的強度受細胞壁中肽聚糖結構的影響，更準確地說是受其氨基酸組成的影響（Niderkorn等人，2009）。

       El-Nezami等人研究了鼠李糖乳桿菌GG和鼠李糖乳酸桿菌LC-705從液體培養基中去除ZEN及其衍生物α-玉米赤霉烯醇的能力（2002c）。他們注意到，這些毒素（38％和46％）中有相當一部分被細菌顆粒捕獲，并且在培養3天后沒有觀察到ZEN或α-玉米赤霉烯醇的降解產物。 作者補充道，經過熱處理和酸處理的細菌都能夠去除ZEN和α-玉米赤霉烯醇，表明吸附作用才是從培養基中去除兩種毒素的機制，而非代謝作用。該過程是快速的并且取決于細菌細胞及毒素的濃度。

        Niderkorn等人 （2007）報道，8株乳桿菌和3種明串珠菌屬將ZEN轉化成α-玉米赤霉烯醇，但DON和伏馬毒素不能被生物轉化。 他們補充道，這不能被認為是解毒，因為α-玉米赤霉烯醇具有比ZEN高3到4倍的雌激素活性（Mirocha等，1979）。 從ZEN到α-玉米赤霉烯醇的生物轉化可能解釋了Mokoena等人的研究結果（2005），他們觀察到LAB在玉米粉發酵過程中ZEN的濃度顯著降低，但其毒性并沒有降低。 意味著ZEN通過疏水相互作用主要結合LAB細胞壁的碳水化合物部分（El-Nezami等人，2004）。 由于疏水相互作用相對較弱，這種細菌-霉菌毒素復合物可能不穩定。 Niderkorn等人（2007）也提出，細菌吸附ZEN不限于疏水性連接，其他類型的相互作用可能也是重要的。 

 

霉菌毒素的體外去除機制

       為了研究LAB去除霉菌毒素的機制，有許多研究比較了活菌和熱滅活菌的作用（Haskard et al.2001; El-Nezami et al。1998b，2002a）?；蛘?，將細菌細胞用酶（如鏈霉蛋白酶E和脂肪酶）或高碘酸鹽處理，以改變細胞壁結構（Haskard等人2000; El-Nezami等人2004; Lahtinen等人2004）。 然而，由于LAB的細胞溶質制劑也有降低毒性的作用，所以假定其他機制（例如與短鏈脂肪酸的相互作用）也可能發揮作用（Knasmuller et al.2001; Stidl et al 2007; Stidl等人2008）。

       在LAB中，細胞壁組成包括（1）肽聚糖層，其形成容納其它組分如磷壁酸和脂磷壁酸的細胞壁的主要結構；（2）蛋白質S層，以及（3）中性多糖（Delcour等人1999）。這些組分具有各種功能，包括粘附以及與大分子結合。各種實驗的結果表明，肽聚糖和多糖參與毒素吸附（Zhang和Ohta， 1991; Peltonen等，2001; Haskard等，2001; Lahtinen等，2004）。 Haskard等人（2000）研究了AFs和鼠李糖乳桿菌之間結合的機制，發現結合主要發生在碳水化合物上，并且一些擴展了細胞壁中的蛋白質組分。這些結果是基于高碘酸酯和鏈霉蛋白酶E對鼠李糖乳桿菌AFB1結合的抑制作用。高碘酸酯和鏈霉蛋白酶E可分別用于相對非特異性降解碳水化合物和蛋白質。他們還描述了疏水相互作用在結合中的主要作用，靜電相互作用次之。

        另外，已經表明AFB1通過弱的非共價相互作用結合細菌，例如與細菌表面上的疏水基團相關聯（Peltonen等，2001）。 然而，AFB1結合可能涉及多個成分（Turbic等人，2002），并且這種相互作用可能受環境條件的影響。

 

霉菌毒素的體內去除機制

       已經顯示幾種益生菌在體外能有效地結合AFB1（Lee等人2003; Shahin 2007），但離體結果有爭議（El-Nezami等人2000）。因為在動物腸道環境條件下其結果可能完全不同，例如pH（Haskard et al.2000,2001）和腸粘液。Gratz等人 （2004）報道，將兩種益生菌制劑（鼠李糖乳桿菌GG和鼠李糖乳桿菌LC-705加弗拉登克氏原乳桿菌shermanii JS（LC-705 + JS）與AFB1或粘液的預培養分別減少了隨后的粘液和AFB1的表面結合 ，表明復合的益生菌制劑在粘液存在下對AFB1的吸附減少，并且更易受腸道中干擾因子的影響，這可能解釋動物體內AFB1結合較差的原因（Gratz等人，2004）。

       2005年，Gratz等研究了益生菌混合物（鼠李糖乳桿菌LC-705加弗氏弗氏厭心菌亞種shermanii JS）離體結合AFB1的能力。結果顯示，益生菌混合物使十二指腸中AFB1的水平降低了25％。 此外，Tuomola等人 （2000）的研究顯示，熱處理可以干擾鼠李糖乳桿菌GG和LC-705的粘液粘附力，并得出結論：蛋白質必須參與粘液的結合，而碳水化合物可與AFB1結合（Haskard等，2000）。

       還有證據表明，具有最有效的AFB1去除能力的LAB可以減少AFB1在雞的胃腸道中被雞吸收（El-Nezami等人，2000）。 根據El-Nezami等人 （2006）的發現，使用兩種益生菌菌株減少了年輕中國男性對AFB1的吸收。

       Hernandez-Mendoza等（2011）評估了羅伊氏乳桿菌在腸道中結合AFB1的能力，并確定該菌株能夠在腸道中結合AFB1，主要在十二指腸中，并且在接受AFB1加細菌的動物中AFB1-賴氨酸加合物的含量明顯低于僅接受AFB1的AFB1-賴氨酸加合物，因此證明細菌在正常腸道條件下作為生物屏障的能力，從而降低口服攝入的AFB1的生物利用度。 Hathout等人 （2011）評估了干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌對大鼠AF-誘導的氧化應激的保護作用，并報道了用細菌處理能夠顯著改善肝臟的所有生物化學參數和組織學圖像。

 

結論

       活的或滅活的乳酸菌可以通過將毒素結合到其細胞壁組分，或通過將毒素降解為毒性較低或無毒的化合物，從而實現去除食物或飼料中的霉菌毒素。鼠李糖乳桿菌GG、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等可利用其細胞壁中的肽聚糖有效地結合霉菌毒素。乳桿菌和雙歧桿菌對霉菌毒素的結合能力，可應用為食品與飼料中的霉菌毒素脫毒劑。